1. Phân tích hồng cầu (RBC) và tiểu cầu (PLT)
– Tại buồng đếm RBC/PLT, các hồng cầu hình đĩa lõm 2 mặt và tiểu cầu hình đĩa lồi 2 mặt được xử lý cầu hóa đẳng tích bằng SDS và được cố định hình dạng hình cầu bằng Glutaraldehyde, nhằm loại trừ sai sót do những tư thế khác nhau của hồng cầu/tiểu cầu khi đi ngang qua điểm đo.
– Sau khi xử lý, hồng cầu/tiểu cầu có dạng hình cầu nhưng vẫn giữ thể tích ban đầu, nhờ dạng hình cầu mà máy có thể đo ở mọi tư thế mà vẫn đảm bảo phản ánh đúng thể tích.
PHÂN TÍCH HỒNG CẦU
– Hồng cầu khi đi ngang qua điểm đo, được chiếu nguồn Laser 670 nm, ánh sáng sau đó được phân tán thành nhiều hướng. Máy phân tích tán xạ ở 2 góc:
- Góc hẹp 2-3 độ: phản ánh thể tích hồng cầu (CV-Cell volume)
- Góc rộng 5-15 độ: phản ánh hàm lượng HGB trong hồng cầu (CH-Cell hemoglobin).
– Tín hiệu thu được trên mỗi góc là cặp dữ liệu liên quan đến mỗi hồng cầu đi ngang qua điểm đo và được đánh dấu trên biểu đồ theo lý thuyết Mie.
– Thông qua dữ liệu ghi được sẽ đưa ra các thông số về hồng cầu như sau:
- RBC: là tổng số tín hiệu đếm được trong ngưỡng quy định
- HC (nồng độ hemoglobin, đơn vị g/dL) = CH/CV
- HCT (thể tích khối hồng cầu) = tổng các CV
- MCV (thể tích trung bình hồng cầu): trung bình cộng của các CV
- MCH (hàm lượng huyết sắc tố trung bình hồng cầu): tổng các CH
- CHCM hay MCHC (nồng độ huyết sắc tố trung bình hồng cầu): trung bình cộng của các CH
- HDW (Hemoglobin distribution width): độ phân bố nồng độ hemoglobin
- CHDW (Content hemoglobin distribution width): độ phân bố hàm lượng hemoglobin
– Biểu đồ chính trình bày sự phân bố và tương quan giữa CV và CH; còn có các biểu đồ trình bày sự phân bố của CV, CH, HC. Biểu đồ chính sẽ xếp loại tế bào theo tiêu chuẩn:
- Hồng cầu nhỏ (micro): CV < 60 fL
- Hồng cầu to (macro): CV > 120 fL
- Hồng cầu nhược sắc (hypo): CH < 28 g/dL
- Hồng cầu ưu sắc (hyper): CH > 41 g/dL
– Có thể xem được các thông số phụ là % số tế bào được xếp loại là micro, macro, hypo và hyper.
Dựa trên các thông số % phụ này mà các cảnh báo về hình thái tế bào (morphology flag) sẽ được đưa ra khi thỏa các điều kiện quy định trước cho các loại cảnh báo này: ANISO (hồng cầu to nhỏ không đều), macro, micro; HCVAR (nồng độ hemoglobin hồng cầu không đều), hypo, hyper.
– Ngoài ra còn các cảnh báo hình thái khác liên quan đến hình dạng bất thường của hồng cầu hoặc các loại nhiễu có thể có: RBC fragments (mảnh vỡ hồng cầu), RBC Ghosts (bóng ma hồng cầu), NRBC (hồng cầu nhân). Các ngưỡng quy định cho cảnh báo hình thái đều có thể thay đổi được do người sử dụng.
PHÂN TÍCH TIỂU CẦU
– Tiểu cầu đi ngang qua điểm đo, được chiếu nguồn Laser 670 nm. Tiểu cầu được khảo sát 2 chiều ở ngưỡng thấp, phân tích tán xạ ở 2 góc:
- Góc hẹp 2-3 độ: phản ánh kích thước tiểu cầu
- Góc rộng 5-15 độ: phản ánh mật độ tế bào (Cell density)
Tín hiệu thu được trên mỗi góc là cặp dữ liệu liên quan đến mỗi tiểu cầu đi ngang qua điểm đo, theo nguyên tắc khảo sát từng tế bào cell by cell, và được đánh dấu trên biểu đồ theo lý thuyết Mie như khảo sát hồng cầu.
– Đặc điểm của phân tích tiểu cầu là phân tích cả các tiểu cầu to (Large Platelets), nhưng nếu phân tích và đếm số lượng tiểu cầu to sẽ có nguy cơ nhầm lẫn với các tế bào bất thường khác như: mảnh hồng cầu (RBC Fragments), bóng ma hồng cầu (RBC ghost),..; cũng như kích thước các tiểu cầu to thường chống lấn, lẫn với hồng cầu, đặc biệt là hồng cầu nhỏ. Do đó cần thêm yếu tố mật độ tế bào (cell density).
Phân tích Hemoglobin (HGB)
– Phương pháp Laser có thể đo trực tiếp HGB trong hồng cầu mà không cần ly giải hồng cầu bằng Cyanmethemoglobin. Các thông số MCV, MCH được tính toán từ Hemoglobin đo được, được kiểm tra chéo với thông số CH và CHCM đo trực tiếp trên tế bào không ly giải. Khi 2 thông số đo có sự chênh lệch vượt quá giới hạn nhất định sẽ có những cảnh bảo của máy và nguyên nhân có thể là:
- Mẫu có nhiều mỡ (Lipidemic), Bilirubin hay Chylomicron
- Mẫu thử có số lượng bạch cầu cao > 60 G/L
- Tiểu cầu kết cụm, mẫu thử ở trẻ sơ sinh
- Sai số kỹ thuật xảy ra ở kênh Hemoglobin hoặc RBC
Phân tích Hồng cầu lưới (RET-Reticulocyte)
– Phương thức xử lý và phân tích tương tự như khảo sát hồng cầu, nhưng hồng cầu lưới được nhuộm với Oxazine 750 để nhuộm màu acid nucleic và khảo sát độ hấp thu chất màu này trên nguồn sáng Laser 670 nm, đối chiếu trực tiếp với kích thước và hàm lượng Hemoglobin của hồng cầu lưới. Kết quả khảo sát được, cho phép đưa ra được các thông số về hồng cầu lưới như sau:
- Retic (Reticulocyte – hồng cầu lưới) : số lượng tuyệt đối và phần trăm % so với tổng số hồng cầu
- CHr (hàm lượng hemoglobin hồng cầu lưới)
- MCVr (thể tích trung bình hồng cầu lưới)
- CHCMr (nồng độ hemoglobin trung bình hồng cầu lưới)
Nguyên tắc phân tích Bạch Cầu – Kênh Basophil-Lobularity
– Dựa trên nguyên tắc: Bạch cầu đoạn ưa base (Basophilic segmented) có tính đề kháng với sự ly giải hỗn hợp acid phtaleic và chất surfactant (chất hoạt hóa bề mặt). Máu toàn phần được trộn với thuốc thử (Phtaleic acid & Surfactant) làm tế bào hồng cầu và bào tương của các loại tế bào khác bị ly giải, ngoại trừ bạch cầu đoạn ưa base, chỉ còn lại tế bào bạch cầu base và nhân các tế bào bạch cầu khác.
– Hỗn hợp mẫu thử được phân tích trên cùng hệ thống quang học như phân tích hồng cầu: nguồn sáng là Laser diod 670nm, phân tích tán xạ:
- Góc hẹp 2-3 độ: phản ảnh kích thước bạch cầu
- Góc rộng 5-15 độ: phản ảnh độ phức tạp của nhân bạch cầu (số múi nhân).
Nguyên tắc phân tích Bạch Cầu
– Peroxidase có trong nhiều loại bạch cầu khác nhau. Dựa vào đó, tiến hành nhuộm Peroxidase bằng hỗn hợp Hydrogen peroxide và chất màu thích hợp. Sau khi nhuộm, Peroxidase tạo ra một chất màu đậm bên trong bạch cầu. Phương pháp này cho phép phân lập rõ Monocyte khỏi nhóm Neutrophil cũng như nhóm các tế bào to không bắt màu LUC (Large Unstained Cell). Do đó kênh Peroxidase cho phép đếm chính xác 3 nhóm bạch cầu bắt màu (Neutrophil, Eosinophil và Monocyte) và 2 nhóm không bắt màu (Lymphocyte và LUC):
- Neutrophil và Eosinophil được nhận biết do có hoạt tính peroxidase rất cao, nhưng có thể phân biệt hai loại tế bào này nhờ sự khác biệt về kích thước.
- Monocyte chứa một hàm lượng thấp peroxidase, nên có thể phân biệt thành một quần thể riêng biệt, tách khỏi nhóm LUC, nhưng có thể lẫn với một số tế bào Neutrophil chứa quá ít peroxidase trong bào tương.
